Plasmide CRISPR d'Activation (m) TRC8: sc-429220-ACT

Rnf139 code TRC8, une ligase E3 ubiquitine de type RING finger résidente du réticulum endoplasmique, impliquée dans le renouvellement des protéines dépendant de l’ubiquitine et la dégradation associée au RE (ERAD). En couplant l’ubiquitination à l’élimination par le protéasome, TRC8 contribue à la protéostase et peut influencer des processus régulés par les lipides et les stérols via des interactions avec des régulateurs de signalisation et du métabolisme associés aux membranes. Une activité altérée de TRC8 a été liée à une dérégulation du contrôle de la croissance et des réponses au stress cellulaire, faisant de Rnf139 un nœud d’étude utile pour analyser la signalisation par l’ubiquitine dans des voies pertinentes pour la stabilité du génome, l’homéostasie métabolique et la transformation oncogénique. Dans des modèles murins, la modulation de l’expression de Rnf139 permet des études mécanistiques de la protéostase et du remodelage des voies de signalisation spécifiques à certains tissus.

TRC8 Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Rnf139 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

TRC8 Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Rnf139 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Rnf139, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de TRC8. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Rnf139 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de TRC8 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie TRC8 dans les cellules tumorales présentant une expression de Rnf139 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.