Plasmide CRISPR d'Activation (h) TRB-2: sc-403132-ACT

TRIB2 (TRB-2) humain code une pseudokinase qui agit comme adaptateur/plateforme (scaffold) pour réguler la transduction du signal plutôt que de catalyser la phosphorylation. TRB-2 module des programmes associés aux voies MAPK/ERK et PI3K/AKT et s’articule avec le contrôle ubiquitine–protéasome de facteurs de transcription tels que les protéines de la famille C/EBP, influençant la différenciation, la prolifération et les réponses au stress. Une expression altérée de TRIB2 a été associée à une dérégulation de la différenciation hématopoïétique et myéloïde, et la protéine est fréquemment étudiée en biologie des cancers, où elle contribue à des dépendances de signalisation oncogénique. Ces propriétés font de TRIB2 un nœud utile pour disséquer le dialogue entre voies de signalisation contrôlant les décisions de destin cellulaire et la survie en conditions de stress.

TRB-2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de TRIB2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

TRB-2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus TRIB2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription TRIB2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de TRB-2. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus TRIB2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de TRB-2 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie TRB-2 dans les cellules tumorales présentant une expression de TRIB2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.