Plasmide CRISPR d'Activation (h) TRAP230: sc-404820-ACT

MED12 code pour TRAP230, une sous-unité essentielle du complexe coactivateur transcriptionnel Mediator, qui relie des facteurs de transcription spécifiques de séquence à l’ARN polymérase II afin de coordonner des programmes d’expression génique. TRAP230 est impliquée dans la transcription dépendante des signaux, notamment dans les voies en aval de Wnt/β-caténine, des récepteurs nucléaires et d’autres régulateurs du développement, influençant ainsi les décisions de destin cellulaire, la prolifération et la différenciation. Une altération de la fonction ou de l’expression de MED12 a été associée à des syndromes neurodéveloppementaux et à de multiples contextes tumoraux via une dérégulation du contrôle transcriptionnel et de l’activité des enhancers. Par conséquent, MED12/TRAP230 est largement étudiée dans l’expression génique régulée par la chromatine, la spécification de lignée et le remodelage des réseaux transcriptionnels.

TRAP230 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de MED12 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

TRAP230 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus MED12 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription MED12, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de TRAP230. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus MED12 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de TRAP230 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie TRAP230 dans les cellules tumorales présentant une expression de MED12 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.