Plasmide CRISPR d'Activation (h) TRABID: sc-402852-ACT

Le gène humain ZRANB1 code TRABID, une déubiquitinase de la famille OTU qui clive préférentiellement les chaînes de polyubiquitine liées en K29 et K33 afin de remodeler la signalisation dépendante de l’ubiquitine. TRABID a été impliquée dans la régulation des programmes transcriptionnels Wnt/β-caténine et de la signalisation inflammatoire associée à NF-κB via la modulation de composants ubiquitinylés des voies, influençant l’expression génique et l’homéostasie cellulaire. En modifiant la topologie des chaînes d’ubiquitine, TRABID contribue au contrôle de la stabilité des protéines et de la propagation des signaux dans des contextes tels que la prolifération, la différenciation et les réponses au stress. La dérégulation de ces voies relie les mécanismes impliquant TRABID à la biologie du cancer, aux perturbations de la signalisation immunitaire et à d’autres phénotypes cellulaires pertinents pour les maladies, qui peuvent être étudiés dans des systèmes modèles.

TRABID Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de ZRANB1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

TRABID Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus ZRANB1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription ZRANB1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de TRABID. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus ZRANB1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de TRABID au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie TRABID dans les cellules tumorales présentant une expression de ZRANB1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.