Plasmide CRISPR d'Activation (h) TPO: sc-417243-ACT

Le gène humain **THPO** code la thrombopoïétine (**TPO**), une cytokine sécrétée qui constitue le principal régulateur de la prolifération des mégacaryocytes et de la production de plaquettes. La TPO signale principalement via **MPL** pour activer les voies **JAK2/STAT5**, **PI3K/AKT** et **MAPK**, soutenant le maintien des cellules souches et progénitrices hématopoïétiques ainsi que l’engagement de lignée. Une signalisation **THPO–MPL** dérégulée a été associée à une altération de l’homéostasie plaquettaire et contribue à la physiopathologie des néoplasies myéloprolifératives et d’autres troubles de l’hématopoïèse. En tant que facteur endocrinien à prédominance hépatique, avec un contrôle par rétroaction dépendant de la masse plaquettaire, **THPO** constitue un point d’entrée pertinent pour étudier les programmes transcriptionnels induits par les cytokines et la signalisation de la niche hématopoïétique.

TPO Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de THPO sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

TPO Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus THPO dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription THPO, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de TPO. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus THPO natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de TPO au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie TPO dans les cellules tumorales présentant une expression de THPO silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.