Plasmide CRISPR d'Activation (h) TPCN1: sc-404943-ACT

Le gène humain **TPCN1** (two-pore channel 1) code un canal cationique endolysosomal qui régule la libération de Ca2+ sensible au **NAADP** à partir des organites acides, en coordonnant les microdomaines de calcium intracellulaire avec le trafic membranaire. En modulant la dynamique endosome–lysosome, la fusion vésiculaire et l’excitabilité des organites, TPCN1 influence l’autophagie, le recyclage des récepteurs et des voies de signalisation liées au métabolisme cellulaire et aux réponses au stress. Les altérations de la gestion endolysosomale du Ca2+ et les phénotypes de trafic associés à l’activité de TPCN1 sont pertinentes pour l’étude de la neurodégénérescence, des dysfonctionnements cardiométaboliques et des mécanismes d’entrée des agents pathogènes dans l’hôte. Par conséquent, TPCN1 est fréquemment étudié dans des modèles reliant la fonction lysosomale à la transduction de signaux dépendante du Ca2+ et à la protéostase.

TPCN1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de TPCN1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

TPCN1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus TPCN1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription TPCN1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de TPCN1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus TPCN1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de TPCN1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie TPCN1 dans les cellules tumorales présentant une expression de TPCN1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.