Plasmide CRISPR d'Activation (h) TORC2: sc-402481-ACT

Le CRTC2 humain (TORC2) est un coactivateur transcriptionnel régulé par CREB qui intègre les signalisations cAMP/PKA et calcique aux programmes d’expression génique métabolique. En couplant CREB à l’activité des promoteurs et des amplificateurs (enhancers), TORC2 contribue à contrôler les sorties transcriptionnelles liées à la gluconéogenèse et au métabolisme lipidique, et participe à des réponses adaptatives telles que l’équilibre énergétique et la signalisation du stress. Son activité est modulée par une séquestration cytoplasmique dépendante de la phosphorylation et par une translocation nucléaire, reliant ainsi les voies de kinases en amont au contrôle transcriptionnel. Une dérégulation de la signalisation CRTC2 a été associée à une altération de l’homéostasie métabolique et à des perturbations des réseaux transcriptionnels pertinents pour des phénotypes métaboliques et prolifératifs.

TORC2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de CRTC2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

TORC2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus CRTC2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription CRTC2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de TORC2. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus CRTC2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de TORC2 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie TORC2 dans les cellules tumorales présentant une expression de CRTC2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.