Plasmide CRISPR d'Activation (h) Topo IIIα: sc-404439-ACT

TOP3A code la topoisomérase IIIα de l’ADN, une topoisomérase de type IA qui résout le stress topologique de l’ADN et les intermédiaires de recombinaison au cours de la réplication et de la réparation. Topo IIIα agit avec l’hélicase BLM, RMI1 et RMI2 au sein du complexe BTRR pour dissoudre les doubles jonctions de Holliday et supprimer les événements de crossing-over aberrants, favorisant ainsi la stabilité du génome. Grâce à ses rôles dans la recombinaison homologue, le redémarrage des fourches de réplication et la décaténation de l’ADN emmêlé, TOP3A contribue au maintien d’une ségrégation correcte des chromosomes et à l’entretien de l’ADN mitochondrial. La perturbation de ce réseau est associée à une augmentation des échanges entre chromatides sœurs et à des phénotypes d’instabilité génomique pertinents en cancérologie et dans les maladies héréditaires de maintenance du génome.

Topo IIIα Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de TOP3A sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Topo IIIα Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus TOP3A dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription TOP3A, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Topo IIIα. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus TOP3A natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Topo IIIα au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Topo IIIα dans les cellules tumorales présentant une expression de TOP3A silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.