Topo IIIα Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-404439-ACT

TOP3A codifica a DNA topoisomerase IIIα, uma topoisomerase do tipo IA que resolve o estresse topológico do DNA e intermediários de recombinação durante a replicação e o reparo. A Topo IIIα atua com a helicase BLM, RMI1 e RMI2 no complexo BTRR para dissolver junções de Holliday duplas e suprimir eventos aberrantes de crossing-over, promovendo assim a estabilidade do genoma. Por meio de funções na recombinação homóloga, no reinício de forquilhas de replicação e na decatenação de DNA entrelaçado, a TOP3A ajuda a manter a segregação cromossômica adequada e a manutenção do DNA mitocondrial. A desregulação dessa rede está associada ao aumento de trocas entre cromátides-irmãs e a fenótipos de instabilidade genômica relevantes para a biologia do câncer e para distúrbios hereditários de manutenção do genoma.

Topo IIIα O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de TOP3A sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Topo IIIα O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus TOP3A em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição TOP3A, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Topo IIIα. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus TOP3A nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Topo IIIα no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Topo IIIα em células tumorais com expressão de TOP3A silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.