Plasmide CRISPR d'Activation (h) Tom70: sc-402022-ACT

TOMM70 code pour Tom70, une sous-unité réceptrice de la translocase de la membrane externe mitochondriale, qui reconnaît les préprotéines liées à des chaperonnes et facilite leur import dans les mitochondries. En coordonnant l’acheminement de protéines porteuses hydrophobes et d’autres protéines mitochondriales codées par le noyau, Tom70 contribue au maintien de la protéostase mitochondriale, de la biogenèse de la chaîne respiratoire et de l’homéostasie métabolique. La perturbation ou la dérégulation des processus d’import associés à TOMM70 est liée à des réponses de stress mitochondrial susceptibles d’influencer la signalisation de l’immunité innée, l’apoptose et l’adaptation cellulaire à la demande énergétique. L’altération de la capacité d’import mitochondrial a été étudiée dans le contexte de la neurodégénérescence, des dysfonctionnements cardiométaboliques et du remodelage métabolique associé au cancer, faisant de TOMM70 un nœud pertinent pour explorer les mécanismes pathologiques pilotés par les mitochondries.

Tom70 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de TOMM70 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Tom70 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus TOMM70 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription TOMM70, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Tom70. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus TOMM70 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Tom70 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Tom70 dans les cellules tumorales présentant une expression de TOMM70 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.