Plasmide CRISPR d'Activation (h) TLR4: sc-400068-ACT

Le TLR4 (Toll-like receptor 4) humain est un récepteur de reconnaissance de motifs (pattern recognition receptor) qui détecte le lipopolysaccharide ainsi que d’autres motifs moléculaires associés aux agents pathogènes et aux dommages à la membrane plasmique. Après liaison du ligand avec des corécepteurs tels que MD-2 et CD14, TLR4 déclenche des cascades de signalisation dépendantes de MyD88 et de TRIF qui activent NF-κB, AP-1 et IRF3, induisant des programmes transcriptionnels responsables de la production de cytokines inflammatoires et des réponses à l’interféron de type I. Ces voies coordonnent l’activation de l’immunité innée, le recrutement des leucocytes et le dialogue avec l’immunité adaptative via les cellules présentatrices d’antigènes. Une signalisation TLR4 dérégulée a été impliquée dans des états d’inflammation chronique et des pathologies immunomédiées, et elle est largement étudiée notamment dans la biologie du sepsis, l’athérosclérose, l’inflammation métabolique et l’inflammation associée aux tumeurs.

TLR4 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de TLR4 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

TLR4 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus TLR4 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription TLR4, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de TLR4. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus TLR4 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de TLR4 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie TLR4 dans les cellules tumorales présentant une expression de TLR4 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.