Plasmide CRISPR d'Activation (m) Thrombospondin 5: sc-419759-ACT

Comp code la thrombospondine 5 (cartilage oligomeric matrix protein, COMP), une glycoprotéine sécrétée de la matrice extracellulaire, enrichie dans le cartilage et le tendon, qui soutient l’assemblage de la matrice et l’intégrité mécanique des tissus. La thrombospondine 5 participe à la fibrillogenèse du collagène et à l’organisation de la matrice extracellulaire, et influence les interactions cellule–matrice qui façonnent la différenciation des chondrocytes et le développement squelettique. Une expression altérée de COMP ou un mauvais repliement de la protéine est associé à un dysfonctionnement de la plaque de croissance, à des réponses de stress du réticulum endoplasmique et à un remodelage du cartilage lié à la dégénérescence. Dans des modèles murins, Comp est largement utilisé pour étudier l’homéostasie de la matrice extracellulaire, la mécanobiologie et les voies contribuant à la pathologie du cartilage et aux phénotypes des tissus conjonctifs.

Thrombospondin 5 Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Comp sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Thrombospondin 5 Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Comp dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Comp, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Thrombospondin 5. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Comp natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Thrombospondin 5 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Thrombospondin 5 dans les cellules tumorales présentant une expression de Comp silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.