Plasmide CRISPR d'Activation (h) Thrombin R: sc-400556-ACT

F2R code le récepteur 1 activé par les protéases (PAR1), un GPCR à sept domaines transmembranaires qui est activé par une protéolyse médiée par la thrombine, déclenchant une signalisation biaisée via des protéines G hétérotrimériques. PAR1 se couple notamment aux voies Gαq/11, Gα12/13 et Gαi pour réguler la signalisation de la phospholipase C, la mobilisation du Ca2+ intracellulaire, le remodelage du cytosquelette piloté par RhoA, les cascades MAPK, ainsi que des programmes transcriptionnels qui influencent la fonction de barrière endothéliale, l’activation plaquettaire et les réponses inflammatoires. Dans des contextes vasculaires et stromaux, F2R intègre des signaux de coagulation avec la migration et l’adhérence cellulaires, ainsi que des modifications de perméabilité, ce qui le rend pertinent pour l’étude de l’inflammation associée à la thrombose, de l’athérogenèse et de la signalisation du microenvironnement tumoral. Une signalisation PAR1 dérégulée a été associée à une réactivité vasculaire anormale et à des phénotypes pro‑inflammatoires dans plusieurs modèles de maladie, ce qui étaye son utilisation comme cible mécanistique en recherche sur l’hémostase et la biologie vasculaire.

Thrombin R Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de F2R sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Thrombin R Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus F2R dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription F2R, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Thrombin R. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus F2R natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Thrombin R au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Thrombin R dans les cellules tumorales présentant une expression de F2R silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.