Plasmide CRISPR d'Activation (h) THP: sc-401238-ACT

UMOD code l’uromoduline (THP), la glycoprotéine la plus abondante sécrétée dans l’urine humaine normale et un produit caractéristique des cellules épithéliales du segment ascendant épais de l’anse de Henle. La THP est synthétisée dans le réticulum endoplasmique, subit une glycosylation extensive ainsi qu’un ancrage GPI, puis est libérée au pôle apical, où elle contribue à l’homéostasie tubulaire, à l’agrégation des protéines et aux interactions avec les ions urinaires et les microbes. L’expression d’UMOD et la maturation de la protéine sont liées aux voies de protéostasie épithéliale, notamment le contrôle qualité du RE et le trafic via l’appareil de Golgi, et peuvent moduler la signalisation inflammatoire au sein du microenvironnement tubulaire rénal. La variation génétique ou une expression dérégulée d’UMOD est associée à la susceptibilité aux maladies rénales et à une pathologie tubulo-interstitielle, ce qui en fait un locus utile pour étudier la fonction de l’épithélium rénal et les réponses au stress.

THP Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de UMOD sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

THP Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus UMOD dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription UMOD, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de THP. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus UMOD natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de THP au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie THP dans les cellules tumorales présentant une expression de UMOD silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.