Plasmide CRISPR d'Activation (m) TFIIIB'': sc-436781-ACT

La protéine Bdp1 de la souris code une sous-unité essentielle du facteur général de transcription TFIIIB de l’ARN polymérase III (TFIIIB''), qui coopère avec TBP et les protéines BRF pour assembler le complexe de pré-initiation sur les promoteurs de Pol III. Par cette activité, TFIIIB'' soutient la transcription de petits ARN non codants tels que les ARNt et d’autres transcrits dépendants de Pol III, reliant ainsi la fonction de Bdp1 à la capacité de synthèse protéique, à la croissance cellulaire et aux programmes d’adaptation au stress. Le contrôle transcriptionnel par Pol III est étroitement lié aux voies de signalisation sensibles aux nutriments et aux mitogènes, et il est fréquemment modifié dans des contextes de prolifération dérégulée. Comme l’activité de Pol III influe sur l’homéostasie de la traduction et l’adaptation métabolique, la perturbation de Bdp1 constitue un point d’entrée pertinent pour étudier des « chaînes d’approvisionnement » transcriptionnelles susceptibles d’être déséquilibrées dans des états associés à la maladie.

TFIIIB″ Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Bdp1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

TFIIIB″ Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Bdp1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Bdp1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de TFIIIB″. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Bdp1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de TFIIIB″ au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie TFIIIB″ dans les cellules tumorales présentant une expression de Bdp1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.