Plasmide CRISPR d'Activation (h) TFIIH p89: sc-401124-ACT

ERCC3 code pour l’hélicase humaine TFIIH p89 (XPB), un facteur de déroulement de l’ADN dépendant de l’ATP, indispensable à la fois à l’initiation de la transcription par l’ARN polymérase II et à la réparation par excision de nucléotides (NER). Au sein du complexe TFIIH, TFIIH p89 coordonne l’ouverture du promoteur lors de la transcription et participe à la vérification des dommages ainsi qu’au déroulement autour de la lésion lors de l’élimination d’adduits volumineux de l’ADN, reliant la régulation transcriptionnelle au maintien du génome. La perturbation des processus de réparation médiés par ERCC3 et de la transcription couplée est associée à une hypersensibilité au stress génotoxique et à des maladies syndromiques, notamment le xeroderma pigmentosum et la trichothiodystrophie, faisant d’ERCC3 un nœud central dans l’étude des réponses aux dommages de l’ADN et de l’intégrité transcriptionnelle.

TFIIH p89 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de ERCC3 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

TFIIH p89 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus ERCC3 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription ERCC3, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de TFIIH p89. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus ERCC3 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de TFIIH p89 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie TFIIH p89 dans les cellules tumorales présentant une expression de ERCC3 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.