Plasmide CRISPR d'Activation (h) TFIIH p80: sc-402231-ACT

ERCC2 code l’hélicase humaine TFIIH p80 (XPD), une sous-unité essentielle du complexe TFIIH qui couple le déroulement de l’ADN dépendant de l’ATP à l’initiation de la transcription par l’ARN polymérase II et à la réparation par excision de nucléotides (NER). Par ses rôles dans la réparation couplée à la transcription et la NER du génome global, TFIIH p80 contribue à la stabilité du génome en permettant la reconnaissance et l’élimination de lésions volumineuses de l’ADN, telles que les photoproduits induits par les UV. ERCC2 influence également la progression du cycle cellulaire et la réponse cellulaire aux dommages de l’ADN via la coordination, médiée par TFIIH, des programmes de réparation et de transcription. Des variants pathogènes d’ERCC2 sont associés à des maladies de réparation de l’ADN, notamment le xeroderma pigmentosum, la trichothiodystrophie et le syndrome de Cockayne, faisant d’ERCC2 un locus largement utilisé pour étudier les dysfonctionnements de la NER et le couplage transcription‑réparation.

TFIIH p80 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de ERCC2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

TFIIH p80 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus ERCC2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription ERCC2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de TFIIH p80. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus ERCC2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de TFIIH p80 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie TFIIH p80 dans les cellules tumorales présentant une expression de ERCC2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.