TFIID/TATA Binding Protein/TBP CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400579-ACT

TBP kodiert das TATA-Box-bindende Protein, eine konservierte Kernkomponente des TFIID-Komplexes, der Promotorelemente erkennt und die Assemblierung des Präinitiationskomplexes der RNA-Polymerase II initiiert. Durch die Bindung an die TATA-Box und die koordinierte Rekrutierung allgemeiner Transkriptionsfaktoren unterstützt TBP die basale Transkription und beeinflusst Promotorselektion, Chromatinbindung und die Dynamik der Transkriptionsinitiation. TBP trägt außerdem zu Transkriptionsprogrammen bei, die von Pol I und Pol III gesteuert werden, und ist damit mit Ribosomenbiogenese, tRNA-Synthese und der globalen Proteostase verknüpft. Eine veränderte TBP-Dosierung oder funktionelle Störung wurde mit dysregulierter Genexpression und neurodegenerativen Phänotypen in Verbindung gebracht, was TBP zu einem hilfreichen Ansatzpunkt macht, um die transkriptionelle Homöostase in krankheitsrelevanten Modellen zu untersuchen.

TFIID/TATA Binding Protein/TBP Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TBP-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

TFIID/TATA Binding Protein/TBP Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TBP-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TBP-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen TFIID/TATA Binding Protein/TBP-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TBP-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von TFIID/TATA Binding Protein/TBP-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des TFIID/TATA Binding Protein/TBP-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TBP-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.