Plasmide CRISPR d'Activation (m) TFEB: sc-437332-ACT

Le gène **Tfeb** de la souris code le facteur de transcription EB (TFEB), un régulateur de type « basic helix–loop–helix leucine zipper » (bHLH-LZ) qui coordonne la biogenèse lysosomale et l’autophagie via le réseau de gènes CLEAR. TFEB intègre des signaux nutritionnels et de stress en aval de mTORC1 et de voies de kinases apparentées afin de contrôler la fonction des lysosomes, le trafic endolysosomal et la protéostasie cellulaire. Une activité TFEB altérée a été associée à une dérégulation des voies autophagie–lysosome impliquées dans la neurodégénérescence, les dysfonctionnements métaboliques et des phénotypes de type maladies de surcharge lysosomale, ce qui en fait un nœud clé pour les études mécanistiques des programmes cellulaires d’élimination.

TFEB Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Tfeb sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

TFEB Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Tfeb dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Tfeb, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de TFEB. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Tfeb natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de TFEB au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie TFEB dans les cellules tumorales présentant une expression de Tfeb silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.