Plasmide CRISPR d'Activation (h) TFEB: sc-401388-ACT

Le TFEB humain (transcription factor EB) est un régulateur maître de la biogenèse lysosomale et de l’autophagie, coordonnant l’expression des gènes du réseau CLEAR qui contrôlent la fonction endolysosomale, le trafic membranaire et l’élimination cellulaire. L’activité de TFEB est étroitement liée à la détection des nutriments via une phosphorylation dépendante de mTORC1 et une translocation nucléaire, intégrant les signaux de stress métabolique aux programmes cataboliques. Une signalisation TFEB dérégulée a été associée à une altération de la protéostasie et à des dysfonctionnements liés aux lysosomes observés dans la neurodégénérescence, les maladies de surcharge lysosomale et la biologie des cancers. En tant que nœud transcriptionnel, TFEB constitue un point d’entrée accessible pour étudier le flux autophagique, le remodelage des lysosomes et les réseaux transcriptionnels d’adaptation au stress.

TFEB Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de TFEB sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

TFEB Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus TFEB dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription TFEB, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de TFEB. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus TFEB natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de TFEB au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie TFEB dans les cellules tumorales présentant une expression de TFEB silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.