TFE3 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401179-ACT

TFE3 (Transkriptionsfaktor E3) ist ein basischer Helix-Loop-Helix-Leucin-Zipper-Transkriptionsfaktor der MiT/TFE-Familie, der an E-Box-Motive bindet und Programme koordiniert, die die lysosomale Biogenese, Autophagie und den zellulären Stoffwechsel steuern. Er integriert Nährstoff- und Stresssignale über Wechselwirkungen mit einer mTORC1-abhängigen Regulation und arbeitet mit TFEB/TFE3-gesteuerten lysosomalen Gennetzwerken zusammen, um Vesikeltransport und oxidativen Stoffwechsel zu modulieren. In der Humanpathologie ist eine veränderte TFE3-Aktivität mit einer gestörten Proteostase und angeborenen Immunantworten assoziiert; zudem treten TFE3-Genfusionen oder eine Überexpression wiederholt in Subgruppen des Nierenzellkarzinoms und anderer Neoplasien auf. Diese Eigenschaften machen TFE3 zu einem nützlichen Knotenpunkt, um die transkriptionelle Kontrolle kataboler Signalwege und die Homöostase von Organellen zu untersuchen.

TFE3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TFE3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

TFE3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TFE3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TFE3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen TFE3-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TFE3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von TFE3-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des TFE3-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TFE3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.