Plasmide CRISPR d'Activation (h) TET1: sc-400845-ACT

Le TET1 humain (ten-eleven translocation methylcytosine dioxygenase 1) est une dioxygénase dépendante du Fe(II) et du 2‑oxoglutarate, qui catalyse l’oxydation de la 5‑méthylcytosine en 5‑hydroxyméthylcytosine ainsi qu’en dérivés oxydés ultérieurs, initiant la déméthylation active de l’ADN. Par cette activité, TET1 façonne la régulation épigénétique de la transcription, l’état de la chromatine et les programmes génétiques du développement, influençant des processus tels que la spécification des lignages, la stabilité du génome et les réponses aux dommages de l’ADN. Le remodelage des profils de méthylation de l’ADN dépendant de TET1 s’articule avec les réseaux transcriptionnels et les modificateurs de la chromatine pour contrôler l’activité des enhancers et des promoteurs. Une expression dérégulée de TET1 ou des paysages de 5hmC altérés ont été associés à des états transcriptionnels aberrants dans le cancer, ainsi qu’à des modifications épigénétiques pertinentes pour le neurodéveloppement et la régulation immunitaire, ce qui en fait une cible majeure pour les études mécanistiques des phénotypes gouvernés par l’épigénome.

TET1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de TET1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

TET1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus TET1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription TET1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de TET1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus TET1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de TET1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie TET1 dans les cellules tumorales présentant une expression de TET1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.