TERT CRISPR Activation Plasmid (m): sc-423341-ACT

Maus-Tert kodiert die Telomerase-Reverse-Transkriptase (TERT), den katalytischen Kern des Telomerase-Ribonukleoproteins, das telomerische DNA-Wiederholungen verlängert und so die Integrität der Chromosomenenden erhält. Indem TERT der Telomerverkürzung während der DNA-Replikation entgegenwirkt, unterstützt es die replikative Lebensspanne, die Genomstabilität und die Zellzyklusprogression und greift dabei in Signalwege der DNA-Schadensantwort sowie Seneszenzprogramme ein. Die Regulation von Tert ist zentral für die Homöostase von Stamm- und Vorläuferzellen und ist häufig in Kontexten mit Telomerfehlfunktion verändert, darunter Modelle vorzeitiger Alterungsphänotypen und der Tumorentstehung, in denen die Telomererhaltung die zelluläre Unsterblichkeit beeinflusst. Die Modulation der Tert-Expression wird daher eingesetzt, um die Telomerbiologie, die Chromatin- und Transkriptionskontrolle am Tert-Lokus sowie stressinduzierte Checkpoint-Aktivierung zu untersuchen.

TERT Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Tert-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

TERT Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Tert-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Tert-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen TERT-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Tert-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von TERT-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des TERT-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Tert-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.