Plasmide CRISPR d'Activation (m) TDAG8: sc-420643-ACT

Le gène murin **Gpr65** code **TDAG8**, un récepteur couplé aux protéines G sensible aux protons, qui détecte l’acidose extracellulaire et transduit des signaux via une production d’AMPc dépendante de **Gαs**, ainsi que via des programmes transcriptionnels en aval. L’activité de TDAG8 influence l’activation des cellules immunitaires, les réponses cytokiniques et les décisions de survie dans des microenvironnements acides, reliant la détection du pH à la signalisation inflammatoire et à la fonction des leucocytes. Outre les voies de seconds messagers propres aux GPCR, TDAG8 peut également interagir avec des réseaux de réponse au stress qui modulent la chimiotaxie et le remodelage tissulaire. Une signalisation **Gpr65/TDAG8** dérégulée a été associée à des mécanismes de maladies à médiation immunitaire et à des interactions tumeur–système immunitaire où l’acidose constitue un signal contextuel majeur, ce qui en fait un outil pertinent pour des études mécanistiques de l’inflammation et de la détection du microenvironnement.

TDAG8 Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Gpr65 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

TDAG8 Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Gpr65 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Gpr65, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de TDAG8. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Gpr65 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de TDAG8 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie TDAG8 dans les cellules tumorales présentant une expression de Gpr65 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.