TCP-1 θ CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404844-ACT

CCT8 kodiert die TCP-1-Theta-(CCTθ)-Untereinheit des zytosolischen Chaperonin-Komplexes mit TCP1 (TRiC/CCT), einer ATP-abhängigen Faltungsmaschinerie, die für die Proteostase essenziell ist. TRiC unterstützt die Biogenese und konformationelle Reifung vielfältiger Client-Proteine, darunter Zytoskelett-Komponenten wie Aktin und Tubulin, und beeinflusst damit die Organisation des Zytoskeletts, das Fortschreiten des Zellzyklus sowie die stressadaptive Qualitätskontrolle von Proteinen. Über seine Rolle bei der Aufrechterhaltung der Faltungskapazität ist CCT8 funktionell mit Signalwegen verknüpft, die die Stabilität des Proteoms, die mitotische Integrität und zelluläre Antworten auf proteotoxischen Stress steuern. Eine dysregulierte Chaperonin-Aktivität wurde in der Krebsbiologie mit veränderten Wachstums- und Überlebensprogrammen sowie mit Proteinfehlfaltungsprozessen in Verbindung gebracht, die für neurodegenerative Phänotypen relevant sind, wodurch CCT8 einen nützlichen Ansatzpunkt für mechanistische Untersuchungen der Proteostase darstellt.

TCP-1 θ Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CCT8-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

TCP-1 θ Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CCT8-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CCT8-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen TCP-1 θ-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CCT8-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von TCP-1 θ-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des TCP-1 θ-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CCT8-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.