Plasmide CRISPR d'Activation (h) TCP-1 γ: sc-403203-ACT

CCT3 code la sous-unité gamma humaine TCP-1 du complexe chaperonine cytosolique contenant TCP1 (CCT/TRiC), une machinerie essentielle de repliement dépendante de l’ATP pour de nombreuses protéines nouvellement synthétisées. CCT/TRiC soutient la protéostasie en favorisant le repliement correct de protéines du cytosquelette telles que l’actine et la tubuline, et il influence la maturation de divers régulateurs de signalisation qui façonnent la croissance cellulaire et les réponses au stress. Par ces fonctions, TCP-1 gamma contribue à des voies contrôlant l’organisation du cytosquelette, la progression du cycle cellulaire et le contrôle de la qualité des protéines. Une activité chaperonine dérégulée a été associée à une altération de la stabilité du protéome dans des contextes prolifératifs et neurodégénératifs, faisant de CCT3 un nœud utile pour des études mécanistiques de phénotypes dépendants du repliement.

TCP-1 γ Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de CCT3 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

TCP-1 γ Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus CCT3 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription CCT3, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de TCP-1 γ. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus CCT3 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de TCP-1 γ au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie TCP-1 γ dans les cellules tumorales présentant une expression de CCT3 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.