TBK1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401066-ACT

A TBK1 humana (TANK-binding kinase 1) é uma quinase de serina/treonina que integra a sinalização imune inata e de estresse, atuando a jusante de receptores de reconhecimento de padrões para induzir respostas de interferon tipo I por meio da fosforilação de IRF3/IRF7. A TBK1 também modula a sinalização de NF-κB e regula a autofagia seletiva e a mitofagia por meio da fosforilação de receptores de autofagia como OPTN e p62/SQSTM1, conectando a sinalização inflamatória ao controle de qualidade celular. A atividade desregulada de TBK1 tem sido associada a fenótipos inflamatórios crônicos e a processos neurodegenerativos, e variantes de perda de função em TBK1 estão implicadas no risco de ELA/DFT (ALS/FTD) por prejuízo da autofagia e alteração da sinalização imune. Essas propriedades fazem da TBK1 um nó-chave para o estudo da sinalização cGAS–STING, de respostas antivirais e da proteostase associada à autofagia em modelos de células humanas.

TBK1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de TBK1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

TBK1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus TBK1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição TBK1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de TBK1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus TBK1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de TBK1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via TBK1 em células tumorais com expressão de TBK1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.