TARDBP CRISPR Activation Plasmid (m): sc-433014-ACT

Mouse-Tardbp kodiert TARDBP (TDP-43), ein multifunktionales RNA- und DNA-bindendes Protein, das Transkription, prä‑mRNA-Spleißen, mRNA-Stabilität, -Transport und die Dynamik von Stressgranula reguliert. TARDBP koordiniert Programme des RNA-Stoffwechsels, die neuronale Differenzierung, synaptische Funktion und Proteostase beeinflussen, und ist an einer autoregulatorischen Rückkopplung beteiligt, die eine strikt kontrollierte Expressionshomöostase aufrechterhält. Eine Störung der Lokalisation von TARDBP oder seiner RNA-Bindungsaktivität beeinträchtigt die Assemblierung von Ribonukleoproteinen und kann die Expression von Genen verändern, die an der Organisation des Zytoskeletts und an der mitochondrialen Funktion beteiligt sind. Eine abweichende TARDBP-Biologie ist eng mit Mechanismen assoziiert, die mit Neurodegeneration in Zusammenhang stehen – darunter veränderte RNA-Prozessierung und Proteinaggregationswege – und macht TARDBP zu einem zentralen Knotenpunkt für die Modellierung krankheitsrelevanter zellulärer Phänotypen in Maus-Systemen.

TARDBP Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Tardbp-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

TARDBP Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Tardbp-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Tardbp-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen TARDBP-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Tardbp-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von TARDBP-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des TARDBP-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Tardbp-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.