TANK CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402464-ACT

TANK (TRAF-family member-associated NF-κB activator) ist ein zytosolisches Adapter- und Gerüstprotein, das die Signaltransduktion stromabwärts von Rezeptoren der angeborenen Immunantwort und von Entzündungsrezeptoren koordiniert. Es interagiert mit TRAF-Proteinen sowie Kinasen wie TBK1 und IKK-Komplexen, um die NF-κB- und IRF-abhängige Transkription zu modulieren, und beeinflusst dadurch Interferonantworten, die Zytokinproduktion und Programme des Zellüberlebens. Über diese Signalwegverknüpfungen trägt TANK zur Regulation der antiviralen Abwehr und der entzündlichen Homöostase bei; seine Fehlregulation ist relevant für Studien zu Ungleichgewichten in der Immun-Signalgebung und zu entzündungsassoziierten Krankheitsmechanismen. In humanen Zellen kann eine veränderte TANK-abhängige Netzwerkaktivität genutzt werden, um das Cross-Talk zwischen NF-κB-, Typ-I-Interferon-Signalgebung und Stressantwort-Signalwegen zu untersuchen.

TANK Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TANK-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

TANK Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TANK-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TANK-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen TANK-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TANK-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von TANK-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des TANK-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TANK-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.