Plásmido CRISPR de Activación (h) T1R3: sc-401808-ACT

TAS1R3 codifica el receptor humano del gusto tipo 1 miembro 3 (T1R3), un GPCR de clase C que forma heterodímeros con TAS1R2 o TAS1R1 para mediar la percepción de lo dulce y del umami, respectivamente. Más allá de la gustación, T1R3 se expresa en múltiples tejidos extraorales, donde participa en programas de detección de nutrientes que acoplan ligandos extracelulares a la señalización intracelular, incluidas vías de segundos mensajeros dependientes de proteínas G y flujos de calcio. Estos eventos de señalización pueden influir en el metabolismo celular, las respuestas secretoras y programas transcripcionales vinculados a la homeostasis energética. La actividad y la expresión desreguladas de TAS1R3/T1R3 se han investigado en contextos como fenotipos metabólicos y señalización de nutrientes asociada a tumores, lo que respalda su utilidad como diana mecanística en estudios centrados en vías.

T1R3 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de TAS1R3 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

T1R3 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus TAS1R3 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional TAS1R3, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de T1R3. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo TAS1R3 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de T1R3 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía T1R3 en células tumorales con expresión de TAS1R3 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.