Plasmide CRISPR d'Activation (h) T1R3: sc-401808-ACT

TAS1R3 code le récepteur humain du goût de type 1 membre 3 (T1R3), un RCPG de classe C qui forme des hétérodimères avec TAS1R2 ou TAS1R1 pour assurer respectivement la perception du sucré et de l’umami. Au-delà de la gustation, T1R3 est exprimé dans de nombreux tissus extra-oraux, où il participe à des programmes de détection des nutriments couplant des ligands extracellulaires à une signalisation intracellulaire, notamment des voies de seconds messagers dépendantes des protéines G et des flux calciques. Ces événements de signalisation peuvent influencer le métabolisme cellulaire, les réponses sécrétoires et des programmes transcriptionnels liés à l’homéostasie énergétique. Une activité et une expression dérégulées de TAS1R3/T1R3 ont été étudiées dans des contextes tels que des phénotypes métaboliques et la signalisation des nutriments associée aux tumeurs, ce qui étaye son intérêt en tant que cible mécanistique dans des études axées sur des voies de signalisation.

T1R3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de TAS1R3 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

T1R3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus TAS1R3 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription TAS1R3, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de T1R3. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus TAS1R3 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de T1R3 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie T1R3 dans les cellules tumorales présentant une expression de TAS1R3 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.