Plasmide CRISPR d'Activation (h) T-bet/TBX21: sc-400480-ACT

TBX21 code T-bet, un facteur de transcription de la famille T-box qui agit comme régulateur maître de la différenciation immunitaire de type 1. T-bet intègre les signaux des cytokines et du TCR pour modeler l’accessibilité de la chromatine et les programmes transcriptionnels contrôlant IFNG et d’autres gènes associés aux Th1, influençant la maturation des cellules NK et leur fonction effectrice cytotoxique. Par des interactions de régulation croisée avec des facteurs déterminant la lignée, TBX21 contribue à l’équilibre entre la polarisation Th1 et Th2/Th17 et coordonne les réponses en aval des voies IL-12/STAT4 et IFN/STAT1. Une activité dérégulée de TBX21 a été associée à l’inflammation d’origine immunitaire, à une susceptibilité accrue aux infections et à une surveillance immunitaire antitumorale altérée, ce qui en fait un nœud d’intérêt pour des études mécanistiques de l’immunopathologie.

T-bet/TBX21 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de TBX21 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

T-bet/TBX21 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus TBX21 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription TBX21, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de T-bet/TBX21. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus TBX21 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de T-bet/TBX21 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie T-bet/TBX21 dans les cellules tumorales présentant une expression de TBX21 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.