Plasmide CRISPR d'Activation (h) Synaptotagmin IV: sc-403314-ACT

SYT4 code la synaptotagmine IV, une protéine à domaine C2 associée aux membranes, qui se localise aux vésicules de sécrétion et module l’exocytose Ca²⁺-dépendante dans les neurones et d’autres cellules excitables. Contrairement aux synaptotagmines canoniques qui agissent comme des capteurs rapides du Ca²⁺, la synaptotagmine IV est souvent liée à un réglage dépendant de l’activité de la probabilité de fusion des vésicules, à la plasticité synaptique et à la libération régulée de neuropeptides et de neurotransmetteurs. La fonction de SYT4 recoupe la fusion membranaire médiée par les SNARE, le trafic vésiculaire et les voies de couplage stimulus-sécrétion qui influencent l’adaptation des réseaux neuronaux. Une expression ou une régulation altérée de la machinerie de libération vésiculaire, dont SYT4, a été associée à des phénotypes neurodéveloppementaux et neuropsychiatriques, et est étudiée dans le contexte des dysfonctionnements synaptiques.

Synaptotagmin IV Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de SYT4 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Synaptotagmin IV Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus SYT4 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription SYT4, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Synaptotagmin IV. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus SYT4 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Synaptotagmin IV au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Synaptotagmin IV dans les cellules tumorales présentant une expression de SYT4 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.