Plasmide CRISPR d'Activation (m) SURF-4: sc-423221-ACT

Surf4 code pour SURF-4, une protéine membranaire du réticulum endoplasmique (RE) conservée au cours de l’évolution, impliquée dans le fonctionnement précoce de la voie sécrétoire et le trafic du RE vers l’appareil de Golgi. SURF-4 participe à la sélection des cargos et à des mécanismes de rétention qui contribuent à coordonner le tri des protéines, la sécrétion et la protéostasie, des processus étroitement liés aux réponses au stress du RE. Les altérations du trafic sécrétoire et de l’homéostasie du RE sont largement pertinentes pour la dérégulation métabolique, l’inflammation et des phénotypes neurodégénératifs dans des systèmes modèles, ce qui fait de Surf4 un nœud utile pour étudier comment la charge biosynthétique influence la physiologie cellulaire. En recherche chez la souris, la modulation de Surf4 soutient l’étude du contrôle de la voie sécrétoire dans les hépatocytes, les cellules immunitaires et d’autres tissus à forte demande sécrétoire.

SURF-4 Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Surf4 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

SURF-4 Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Surf4 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Surf4, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de SURF-4. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Surf4 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de SURF-4 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie SURF-4 dans les cellules tumorales présentant une expression de Surf4 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.