Plasmide CRISPR d'Activation (h) Su[fu]: sc-401599-ACT

SUFU (Suppressor of Fused) code la protéine humaine Su[fu], un régulateur négatif central de la signalisation Hedgehog qui freine les facteurs de transcription GLI et contribue à maintenir un niveau d’activité approprié de la voie au cours du développement et de l’homéostasie tissulaire. En modulant le processing des protéines GLI, leur localisation nucléaire et leur activité transcriptionnelle, SUFU s’intègre à une signalisation dépendante du cil primaire ainsi qu’à des réseaux plus larges de contrôle transcriptionnel. La dérégulation de SUFU ou de composants en aval de la voie Hedgehog est associée à une signalisation proliférative aberrante et à une altération de la spécification du destin cellulaire, faisant de SUFU un nœud fréquemment étudié dans le remodelage de la voie. La fonction de SUFU est également pertinente pour l’étude de la biologie des cellules souches/progénitrices, des ciliopathies et des contextes de signalisation oncogénique où la transcription dépendante de GLI est perturbée.

Su[fu] Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de SUFU sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Su[fu] Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus SUFU dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription SUFU, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Su[fu]. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus SUFU natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Su[fu] au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Su[fu] dans les cellules tumorales présentant une expression de SUFU silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.