SUCLA2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404356-ACT

Das humane SUCLA2 kodiert die ATP-bildende Succinyl-CoA-Ligase-Untereinheit beta, ein zentrales Enzym der mitochondrialen Matrix im Tricarbonsäurezyklus (TCA-Zyklus), das die reversible Umwandlung von Succinyl-CoA zu Succinat unter Nukleotidphosphorylierung katalysiert. Indem SUCLA2 den Kohlenstofffluss im oxidativen Stoffwechsel mit der ATP-/GTP-Erzeugung verknüpft, unterstützt es die mitochondriale Bioenergetik, die Anaplerose und die metabolische Kopplung an Signalwege wie die Hämbiosynthese und den Aminosäureabbau. Eine SUCLA2-Fehlfunktion ist mit Defekten der mitochondrialen DNA-Erhaltung und einer beeinträchtigten oxidativen Phosphorylierung assoziiert und trägt zu neuromuskulären sowie enzephalomyopathischen Phänotypen bei, wie sie im Kontext mitochondrialer Erkrankungen beschrieben sind. Als metabolischer Knotenpunkt wird SUCLA2 häufig in Modellen für mitochondrialen Stress, Redox-Ungleichgewichte und energieabhängige zelluläre Prozesse untersucht.

SUCLA2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen SUCLA2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

SUCLA2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des SUCLA2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der SUCLA2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen SUCLA2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native SUCLA2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von SUCLA2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des SUCLA2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem SUCLA2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.