SSAT Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402916-ACT

O SAT1 humano codifica a espermidina/espermina N1-acetiltransferase (SSAT), uma enzima limitante da velocidade no catabolismo de poliaminas que acetila a espermidina e a espermina para promover a sua exportação e a reconversão oxidativa. Ao regular os reservatórios intracelulares de poliaminas, a SSAT influencia a organização da cromatina, os programas transcricionais, as respostas ao stress oxidativo e a progressão do ciclo celular. A atividade de SAT1 cruza-se com a biossíntese de poliaminas e com o metabolismo da metionina/de um carbono através da utilização de acetil-CoA e do controlo por feedback da homeostase de poliaminas. A expressão desregulada de SAT1 e a renovação do pool de poliaminas têm sido associadas a proliferação alterada, sinalização inflamatória, stress metabólico e fenótipos relacionados com cancro, tornando-o um nó útil para estudos mecanísticos de vias.

SSAT O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de SAT1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

SSAT O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus SAT1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição SAT1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de SSAT. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus SAT1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de SSAT no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via SSAT em células tumorais com expressão de SAT1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.