Plasmide CRISPR d'Activation (h) SSAT: sc-402916-ACT

Le gène humain SAT1 code la spermidine/spermine N1‑acétyltransférase (SSAT), une enzyme limitante de la voie du catabolisme des polyamines qui acétyle la spermidine et la spermine afin de favoriser leur export et leur reconversion oxydative. En régulant les réserves intracellulaires de polyamines, la SSAT influence l’organisation de la chromatine, les programmes transcriptionnels, les réponses au stress oxydatif et la progression du cycle cellulaire. L’activité de SAT1 s’articule avec la biosynthèse des polyamines et le métabolisme de la méthionine/du cycle « une‑carbone » via l’utilisation de l’acétyl‑CoA et un contrôle par rétroaction de l’homéostasie des polyamines. Une expression dérégulée de SAT1 et un renouvellement anormal des polyamines ont été associés à des altérations de la prolifération, de la signalisation inflammatoire, du stress métabolique et à des phénotypes liés au cancer, ce qui en fait un nœud pertinent pour des études mécanistiques de voies de signalisation.

SSAT Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de SAT1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

SSAT Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus SAT1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription SAT1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de SSAT. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus SAT1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de SSAT au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie SSAT dans les cellules tumorales présentant une expression de SAT1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.