Squalene epoxidase CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402870-ACT

SQLE kodiert die Squalen-Epoxidase, eine flavinabhängige Monooxygenase, die die Epoxidierung von Squalen zu 2,3‑Oxidosqualen katalysiert – ein verpflichtender, geschwindigkeitsbestimmender Schritt in der Sterolbiosynthese. Dieses ER‑assoziierte Enzym trägt zur Kontrolle von Cholesterin- und anderen Sterolspiegeln bei und verknüpft die SQLE‑Aktivität mit der Membranzusammensetzung, der Dynamik von Lipid Rafts und der Verfügbarkeit steroidogener Vorstufen. SQLE wird durch den zellulären Lipidstatus reguliert und ist in SREBP‑gesteuerte Stoffwechselprogramme eingebunden, die die Cholesterinhomöostase und den breiteren Lipidstoffwechsel koordinieren. Eine fehlregulierte SQLE‑Expression wurde mit veränderten Sterolflüssen und metabolischer Reprogrammierung in mehreren krankheitsrelevanten Kontexten in Verbindung gebracht, darunter proliferative und inflammatorische Zustände.

Squalene epoxidase Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen SQLE-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Squalene epoxidase Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des SQLE-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der SQLE-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Squalene epoxidase-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native SQLE-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Squalene epoxidase-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Squalene epoxidase-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem SQLE-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.