SQSTM1/p62 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400099-ACT

SQSTM1 codifica la sequestosoma 1 (p62), un adattatore multifunzionale che collega i carichi ubiquitinati all’autofagia selettiva tramite il legame con LC3 e coordina la proteostasi attraverso interazioni con il sistema ubiquitina–proteasoma. p62 è un nodo di segnalazione nelle vie di risposta allo stress, inclusa la segnalazione antiossidante KEAP1–NRF2 e l’attivazione di NF-κB, e contribuisce alla regolazione di apoptosi, infiammazione e omeostasi metabolica. Un’espressione alterata o l’aggregazione di SQSTM1/p62 è associata a un flusso autofagico compromesso e a stress proteotossico, caratteristiche osservate nella neurodegenerazione e in altri disturbi che coinvolgono stress cellulare cronico. In quanto scaffold che integra degradazione e segnalazione, SQSTM1 è ampiamente studiato per i suoi ruoli nella formazione di corpi di inclusione, nel controllo di qualità mitocondriale e nella regolazione dell’immunità innata.

SQSTM1/p62 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SQSTM1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

SQSTM1/p62 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SQSTM1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SQSTM1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di SQSTM1/p62. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SQSTM1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da SQSTM1/p62 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via SQSTM1/p62 nelle cellule tumorali con espressione di SQSTM1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.