Plasmide CRISPR d'Activation (h) SQSTM1/p62: sc-400099-ACT

SQSTM1 code la séquestosome 1 (p62), une protéine adaptatrice multifonctionnelle qui relie des cargos ubiquitinylés à l’autophagie sélective via la liaison à LC3 et coordonne la protéostasie grâce à ses interactions avec le système ubiquitine–protéasome. p62 est un nœud de signalisation dans les voies de réponse au stress, notamment la signalisation antioxydante KEAP1–NRF2 et l’activation de NF-κB, et participe à la régulation de l’apoptose, de l’inflammation et de l’homéostasie métabolique. Une expression altérée de SQSTM1/p62 ou son agrégation est associée à une perturbation du flux autophagique et à un stress protéotoxique, caractéristiques observées dans les maladies neurodégénératives et d’autres troubles impliquant un stress cellulaire chronique. En tant que protéine échafaudage intégrant dégradation et signalisation, SQSTM1 est largement étudiée pour ses rôles dans la formation de corps d’inclusion, le contrôle qualité mitochondrial et la régulation de l’immunité innée.

SQSTM1/p62 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de SQSTM1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

SQSTM1/p62 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus SQSTM1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription SQSTM1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de SQSTM1/p62. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus SQSTM1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de SQSTM1/p62 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie SQSTM1/p62 dans les cellules tumorales présentant une expression de SQSTM1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.