Plasmide CRISPR d'Activation (h) Spi-B: sc-402613-ACT

SPIB code pour Spi-B, un facteur de transcription de la famille ETS jouant des rôles majeurs dans la spécification des lignages hématopoïétiques et la maturation des cellules immunitaires, en particulier dans les programmes des cellules B et des cellules dendritiques plasmacytoïdes. Spi-B régule des réseaux de gènes qui contrôlent la signalisation des récepteurs de l’antigène, les réponses associées aux interférons et des circuits transcriptionnels gouvernant les états de différenciation et d’activation. Une expression ou une activité régulatrice altérée de SPIB a été associée à des phénotypes immunitaires dérégulés et a été rapportée dans plusieurs contextes d’hémopathies malignes, ce qui étaye son utilisation comme nœud moléculaire pour étudier le remodelage des programmes transcriptionnels. En tant que régulateur se liant à l’ADN, Spi-B constitue un point d’entrée exploitable pour interroger la logique des promoteurs/activateurs (enhancers) et le contrôle, dépendant de la chromatine, de l’identité des lignages immunitaires.

Spi-B Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de SPIB sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Spi-B Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus SPIB dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription SPIB, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Spi-B. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus SPIB natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Spi-B au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Spi-B dans les cellules tumorales présentant une expression de SPIB silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.