Plasmide CRISPR d'Activation (h) SPAK: sc-404440-ACT

Le gène humain **STK39** code la kinase sérine/thréonine **SPAK** (STE20/SPS1-related proline/alanine-rich kinase), un régulateur de la réponse au stress impliqué dans le transport ionique et l’homéostasie du volume cellulaire. SPAK agit au sein de l’axe de signalisation **WNK–SPAK/OSR1** pour phosphoryler et contrôler des cotransporteurs électroneutres cation–chlorure, influençant la gestion épithéliale du sel, l’équilibre du chlorure dans les neurones et l’adaptation au stress osmotique. En modulant la signalisation de stress liée aux MAPK et la dynamique de phosphorylation des transporteurs, l’activité de STK39 relie des réseaux de kinases intracellulaires aux processus de transport membranaire. Un dérèglement de cette voie a été associé à des altérations de la physiologie des électrolytes et a été étudié dans des contextes tels que le risque d’hypertension, l’excitabilité neurophysiologique et des phénotypes de transport épithélial.

SPAK Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de STK39 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

SPAK Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus STK39 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription STK39, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de SPAK. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus STK39 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de SPAK au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie SPAK dans les cellules tumorales présentant une expression de STK39 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.