SP Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404996-ACT

Il TFF2 umano (trefoil factor 2) codifica un peptide trefoil secreto che sostiene la protezione della mucosa gastrointestinale promuovendo la restituzione dell’epitelio, il mantenimento della barriera e la riparazione in seguito a lesione. TFF2 è indotto durante i programmi infiammatori e di guarigione delle ferite e può influenzare il crosstalk epitelio–immunitario attraverso vie legate alla segnalazione delle citochine, alla migrazione cellulare e al rimodellamento della matrice extracellulare. Un’alterata espressione di TFF2 è stata riportata nella gastrite cronica e negli stati metaplastici ed è frequentemente studiata nel contesto della differenziazione dell’epitelio gastrico, del rimodellamento associato all’infiammazione e della biologia tumorale. Queste proprietà rendono TFF2 un bersaglio utile per analizzare il controllo trascrizionale della difesa mucosale e dei programmi secretori responsivi allo stress nelle cellule umane.

SP Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di TFF2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

SP Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus TFF2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione TFF2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di SP. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus TFF2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da SP nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via SP nelle cellule tumorali con espressione di TFF2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.