Plasmide CRISPR d'Activation (m) SmcX: sc-423030-ACT

Kdm5c (SmcX) code une histone déméthylase liée au chromosome X contenant un domaine Jumonji C (JmjC), qui élimine les marques H3K4me2/3, modulant ainsi l’accessibilité de la chromatine et les programmes transcriptionnels au cours du développement. Dans les cellules de souris, SmcX module le contrôle épigénétique de l’expression génique associée à la différenciation neuronale, à la fonction synaptique et à la transcription dépendante de l’activité, en s’intégrant à des voies qui régulent les décisions de destinée cellulaire ainsi que l’état des promoteurs et des enhancers à l’échelle du génome. La perturbation ou la dérégulation de KDM5C est associée à des phénotypes neurodéveloppementaux et à des altérations des fonctions cognitives, en accord avec son rôle dans le maintien d’une homéostasie transcriptionnelle appropriée. SmcX constitue donc une cible utile pour étudier la régulation dépendante de la chromatine, les réseaux de gènes neuronaux et les contributions épigénétiques à des états cellulaires pertinents pour les maladies.

SmcX Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Kdm5c sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

SmcX Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Kdm5c dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Kdm5c, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de SmcX. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Kdm5c natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de SmcX au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie SmcX dans les cellules tumorales présentant une expression de Kdm5c silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.