Plasmide CRISPR d'Activation (m) Smad6: sc-421529-ACT

Smad6 code une protéine SMAD inhibitrice qui agit comme régulateur de rétrocontrôle négatif de la signalisation BMP et, dans certains contextes, de la signalisation TGF-β, en interférant avec l’activation des SMAD régulées par les récepteurs et les programmes transcriptionnels en aval. Dans les cellules murines, SMAD6 contribue à ajuster des processus dépendants des BMP, tels que la différenciation ostéogénique, l’homéostasie vasculaire et la mise en place des patrons de développement, en limitant l’intensité et la durée du signal. En modulant l’expression génique canonique dépendante des SMAD, SMAD6 influence les décisions de destinée cellulaire, la prolifération et le remodelage de la matrice extracellulaire. Une activité de SMAD6 dérégulée a été associée dans la littérature à une altération de la sortie de la voie BMP, liée à des phénotypes congénitaux et cardiovasculaires ainsi qu’à des anomalies du développement squelettique, ce qui en fait un nœud utile pour des études mécanistiques des voies de signalisation.

Smad6 Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Smad6 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Smad6 Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Smad6 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Smad6, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Smad6. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Smad6 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Smad6 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Smad6 dans les cellules tumorales présentant une expression de Smad6 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.