Smad6 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401411-ACT

Das humane Gen **SMAD6** kodiert **Smad6**, ein inhibierendes SMAD-Protein, das die Signalübertragung nachgeschaltet der **TGF-β-Superfamilie**, insbesondere des **BMP-Zweigs**, abschwächt. Smad6 wirkt als negativer Feedback-Regulator, indem es die Phosphorylierung rezeptorregulierter SMADs stört sowie die Bildung von SMAD-Komplexen und deren transkriptionellen Output moduliert. Über diese Mechanismen beeinflusst es die Musterbildung in der Entwicklung, die osteogene Differenzierung, die endotheliale und vaskuläre Homöostase sowie das Crosstalk mit inflammatorischen Signalwegen. Veränderte SMAD6-Aktivität oder -Expression wurde mit angeborenen kardiovaskulären und kraniofazialen Phänotypen in Verbindung gebracht und in Kontexten untersucht, in denen ein Ungleichgewicht der BMP/TGF-β-Signalwege zu krankheitsrelevantem Remodeling und Kalzifikationsprozessen beiträgt.

Smad6 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen SMAD6-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Smad6 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des SMAD6-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der SMAD6-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Smad6-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native SMAD6-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Smad6-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Smad6-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem SMAD6-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.