Plasmide CRISPR d'Activation (h) Smad5: sc-400443-ACT

SMAD5 code Smad5, un SMAD régulé par le récepteur qui relaie les signaux BMP en aval des récepteurs de type I/II à activité sérine/thréonine kinase. Après phosphorylation, Smad5 forme des complexes avec SMAD4 et s’accumule dans le noyau afin de réguler des programmes transcriptionnels contrôlant l’organisation embryonnaire, la différenciation ostéogénique et vasculaire, ainsi que l’homéostasie tissulaire. La signalisation BMP/SMAD médiée par SMAD5 s’interface avec des réseaux de développement et de différenciation et peut moduler, selon le contexte cellulaire, l’expression de gènes impliqués dans le cycle cellulaire et la spécification des lignages. La dérégulation de la signalisation BMP–SMAD, notamment une activité altérée de SMAD5, est impliquée dans des malformations congénitales et a été étudiée dans des modifications de la différenciation associées aux maladies, des états transcriptionnels liés à la fibrose et la biologie tumorale.

Smad5 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de SMAD5 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Smad5 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus SMAD5 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription SMAD5, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Smad5. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus SMAD5 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Smad5 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Smad5 dans les cellules tumorales présentant une expression de SMAD5 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.