Plasmide CRISPR d'Activation (m) Smad4: sc-421527-ACT

Smad4 murin code un médiateur transcriptionnel central de la signalisation canonique TGF-β et BMP, formant des complexes avec les SMAD régulés par les récepteurs afin de contrôler des programmes d’expression génique qui gouvernent les décisions de destinée cellulaire, la différenciation, le remodelage de la matrice extracellulaire et la modulation immunitaire. L’activité de Smad4 intègre les signaux issus de récepteurs à activité sérine/thréonine kinase jusqu’au noyau, façonnant des réponses transcriptionnelles dépendantes du contexte dans les tissus épithéliaux et mésenchymateux. La perturbation ou la dérégulation de la signalisation dépendante de SMAD4 est largement utilisée comme cadre moléculaire pour étudier les mécanismes de suppression tumorale, de fibrose, de signalisation inflammatoire et de mise en place des patrons du développement chez les mammifères. Dans des modèles murins et des essais sur cellules, Smad4 constitue un nœud expérimentalement accessible pour explorer les interconnexions de voies avec les réseaux MAPK, WNT et PI3K/AKT.

Smad4 Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Smad4 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Smad4 Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Smad4 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Smad4, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Smad4. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Smad4 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Smad4 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Smad4 dans les cellules tumorales présentant une expression de Smad4 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.