Smad4 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-421527-ACT

Maus-Smad4 kodiert einen zentralen transkriptionellen Mediator der kanonischen TGF-β- und BMP-Signalübertragung. Es bildet Komplexe mit rezeptorregulierten SMADs, um Genexpressionsprogramme zu steuern, die Zellschicksalsentscheidungen, Differenzierung, Umbau der extrazellulären Matrix und Immunmodulation kontrollieren. Die Smad4-Aktivität integriert Signale von Serin/Threonin-Kinaserezeptoren in den Zellkern und prägt kontextabhängige transkriptionelle Antworten in epithelialen und mesenchymalen Geweben. Eine Störung oder Fehlregulation der SMAD4-abhängigen Signalgebung wird häufig als molekularer Bezugsrahmen genutzt, um Mechanismen der Tumorsuppression, Fibrose, inflammatorischen Signalübertragung und Entwicklungs-/Musterbildung in Säugersystemen zu untersuchen. In Mausmodellen und zellbasierten Assays stellt Smad4 einen gut zugänglichen Knotenpunkt dar, um Crosstalk mit MAPK-, WNT- und PI3K/AKT-Netzwerken zu analysieren.

Smad4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Smad4-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Smad4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Smad4-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Smad4-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Smad4-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Smad4-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Smad4-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Smad4-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Smad4-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.