SLP-76 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401421-ACT

LCP2 kodiert SLP-76, ein zytosolisches Adapterprotein, das für die Kopplung der Aktivierung von Immunrezeptoren an nachgeschaltete Signalwege in hämatopoetischen Zellen essenziell ist. Nach Stimulation des T‑Zell‑Rezeptors oder von Fc‑Rezeptoren initiiert SLP-76 multiproteinäre Komplexe mit LAT, VAV1, ITK und PLCγ und koordiniert so Phosphorylierungskaskaden, die den Kalziumfluss, die MAPK-Aktivierung, den Umbau des Zytoskeletts sowie Transkriptionsprogramme zur Aktivierung und Differenzierung von Lymphozyten regulieren. Über diese Signalwege beeinflusst SLP-76 die integrinvermittelte Adhäsion, die Bildung der immunologischen Synapse und Effektorantworten und stellt damit einen zentralen Knotenpunkt für die Untersuchung der Dynamik der Antigenrezeptor-Signalübertragung dar. Fehlregulierte proximale Signalgebung in SLP-76-assoziierten Netzwerken ist für Immunfunktionsstörungen und inflammatorische Phänotypen relevant und stützt seinen Einsatz in mechanistischen Modellen der Signalübertragung in Immunzellen.

SLP-76 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen LCP2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

SLP-76 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des LCP2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der LCP2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen SLP-76-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native LCP2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von SLP-76-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des SLP-76-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem LCP2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.