Plasmide CRISPR d'Activation (h) SKI-1: sc-402595-ACT

MBTPS1 code SKI-1/S1P, une proprotéine convertase de type subtilisine résidente de l’appareil de Golgi, qui clive des facteurs de transcription ancrés à la membrane afin de contrôler leur activation et leur translocation nucléaire. SKI-1 est un régulateur amont majeur de l’homéostasie des stérols et des lipides via le processing des SREBP, influençant ainsi les programmes de biosynthèse du cholestérol et des acides gras, ainsi que des réseaux plus larges de signalisation métabolique. Elle participe également aux voies d’adaptation au stress RE–Golgi en modulant l’activation d’ATF6 et des réponses de protéostasie associées. Une dérégulation de l’activité de MBTPS1/SKI-1 a été associée à des phénotypes héréditaires du tissu conjonctif et du squelette, ainsi qu’à des états cellulaires caractérisés par un métabolisme lipidique altéré, ce qui en fait une cible pertinente pour des études mécanistiques en métabolisme, en biologie de la voie sécrétoire et en signalisation du stress.

SKI-1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de MBTPS1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

SKI-1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus MBTPS1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription MBTPS1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de SKI-1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus MBTPS1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de SKI-1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie SKI-1 dans les cellules tumorales présentant une expression de MBTPS1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.