Plasmide CRISPR d'Activation (h) SKAP: sc-406377-ACT

Le gène humain KNSTRN code pour SKAP (small kinetochore-associated protein), un régulateur mitotique qui se localise aux kinétochores et soutient une ségrégation fidèle des chromosomes. SKAP participe à l’attachement kinétochore–microtubules et à des processus liés au point de contrôle du fuseau, contribuant à coordonner l’alignement en métaphase et la progression en anaphase au cours de la mitose. La perturbation ou la dérégulation de KNSTRN/SKAP peut favoriser l’instabilité chromosomique et l’aneuploïdie, des phénomènes fréquemment étudiés en biologie du cancer et en recherche sur le maintien du génome. Par conséquent, KNSTRN est couramment étudié dans les voies qui régissent l’assemblage du fuseau, la progression du cycle cellulaire et la fidélité mitotique.

SKAP Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de KNSTRN sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

SKAP Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus KNSTRN dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription KNSTRN, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de SKAP. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus KNSTRN natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de SKAP au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie SKAP dans les cellules tumorales présentant une expression de KNSTRN silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.