SKAP CRISPR Activation Plasmid (h): sc-406377-ACT

Das humane Gen **KNSTRN** kodiert **SKAP** (small kinetochore-associated protein), einen mitotischen Regulator, der an den Kinetochoren lokalisiert ist und eine zuverlässige Chromosomensegregation unterstützt. SKAP ist an der Anheftung von Kinetochoren an Mikrotubuli sowie an Prozessen beteiligt, die mit dem Spindelkontrollpunkt verknüpft sind, und hilft dabei, die Ausrichtung in der Metaphase und den Übergang in die Anaphase während der Mitose zu koordinieren. Eine Störung oder Fehlregulation von KNSTRN/SKAP kann zu chromosomaler Instabilität und Aneuploidie beitragen – Phänomene, die in der Krebsbiologie und der Forschung zur Genomstabilität häufig untersucht werden. Daher wird KNSTRN häufig in Signalwegen untersucht, die Spindelaufbau, Zellzyklusprogression und mitotische Genauigkeit steuern.

SKAP Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen KNSTRN-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

SKAP Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des KNSTRN-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der KNSTRN-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen SKAP-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native KNSTRN-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von SKAP-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des SKAP-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem KNSTRN-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.