Six2 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-422957-ACT

Six2 (sine oculis homeobox homolog 2) è un fattore di trascrizione homeobox che regola il mantenimento delle cellule progenitrici e la specificazione delle linee cellulari durante l’organogenesi del topo, con ruoli ben definiti nell’autorinnovamento dei progenitori del nefrone e nella morfogenesi ramificata nel rene in sviluppo. Controllando programmi trascrizionali legati alla segnalazione epitelio–mesenchimale e alla differenziazione, SIX2 influenza vie che governano le decisioni sul destino cellulare, la proliferazione e la strutturazione dei tessuti. Un’alterata espressione di Six2 o una deregolazione delle reti trascrizionali della famiglia SIX è stata associata a malformazioni renali congenite e a disturbi dello sviluppo, rendendolo un bersaglio utile per lo studio dei circuiti di regolazione genica nei tessuti embrionali. Inoltre, Six2 è ampiamente utilizzato come marcatore e nodo funzionale nella biologia delle cellule staminali/progenitrici e nei modelli di sviluppo renale.

Six2 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Six2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Six2 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Six2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Six2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Six2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Six2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Six2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Six2 nelle cellule tumorali con espressione di Six2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.