Plasmide CRISPR d'Activation (m) Shh: sc-422926-ACT

Le Sonic hedgehog (Shh) est un morphogène sécrété qui orchestre la mise en place des patrons embryonnaires et l’homéostasie tissulaire postnatale en régulant la spécification du destin cellulaire, la prolifération et la différenciation. Chez la souris, la signalisation SHH est transmise via PTCH1/SMO afin de moduler les facteurs de transcription GLI, en s’intégrant au trafic ciliaire, à la formation de gradients et aux réseaux développementaux de régulation génique. Une perturbation de l’activité de la voie SHH influence les processus neurodéveloppementaux, la morphogenèse des membres et du massif craniofacial, ainsi que les interactions épithélio-mésenchymateuses. Une signalisation SHH dérégulée est largement utilisée comme modèle mécanistique pour étudier les malformations congénitales et les programmes oncogéniques dépendants de Hedgehog dans divers contextes tissulaires.

Shh Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Shh sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Shh Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Shh dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Shh, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Shh. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Shh natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Shh au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Shh dans les cellules tumorales présentant une expression de Shh silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.